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Recombinant Enterokinase重組腸激酶使用說明書

發(fā)布時間:2017/11/15      點(diǎn)擊次數(shù):2066

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Recombinant Enterokinase重組腸激酶

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Recombinant Enterokinase重組腸激酶

D2101L1001

500 U

-20

1050

產(chǎn)品簡介

腸激酶(Enterokinase)是一種絲氨酸蛋白酶高度專一性識別Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,在Lys的C端水解多肽/融合蛋白,去除融合標(biāo)簽,釋放出目的蛋白。但天然腸激酶來源有限,并且從動物組織提取的腸激酶污染有其他蛋白酶,這給實(shí)際應(yīng)用帶來了困難。重組腸激酶(rEK)是高純度的牛腸激酶輕鏈亞基,它有著和天然提取的腸激酶同樣特異的切割酶活性,且切割速率更快。重組腸激酶(rEK)被廣泛地應(yīng)用于基因工程產(chǎn)品的開發(fā),其應(yīng)用之一是作為工具蛋白酶用于重組融合蛋白質(zhì)的特異性斷裂,尤其適用于生物工程制藥業(yè)及基因工程、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等研究。

本產(chǎn)品為采用重組酵母分泌表達(dá)的高純度、高活性的牛腸激酶,適用范圍廣(4~45,pH4.5~9.5),并且在各種去垢劑和變性劑存在的條件下仍具有部分活性。因經(jīng)多次柱純化,SDS-PAGE膠檢測僅可見清晰單一的目的條帶。本制品不含有非特異性的蛋白酶切活性。

技術(shù)參數(shù)

來源(Source

重組酵母Yeast

分子量Molecular Weight

理論值25.850 kDa

外觀(Appearance

透明液體

酶濃度(Enzyme Concentration

4U/uL

活性定義(Activity Definition

在37℃,16小時內(nèi)將0.5毫克的Thioredoxin-NP-27 95%降解為NP-27所需要的酶量定義為1個活性單位(1U) 。

內(nèi)毒素檢測(Endotoxin

LAL法測定內(nèi)毒素含量小于1EU/μg

質(zhì)量保證(Quality assurance

經(jīng)多次柱純化,SDS-PAGE膠檢測僅可見清晰單一的目的條帶;本制品中不含有非特異性的蛋白酶切活性。

運(yùn)輸與保存方法

-20℃保存,冰袋運(yùn)輸。質(zhì)保期12個月

使用方法(參考舉例)

1. 反應(yīng)體系構(gòu)建,以1000μl為例,反應(yīng)體系如下:

融合蛋白

0.5-1mg(蛋白濃度:0.1-1mg/ml)

Recombinant Enterokinase重組腸激酶

0.5-2.5 uL (相當(dāng)于2-10U)

10 x rEK反應(yīng)緩沖液

100μL

超純水

根據(jù)需要補(bǔ)充體積到1000μl

 

注:10 x rEK反應(yīng)緩沖液配方:0.5M Tris-HCl,pH 8.0(22),10mM CaCl,1% Tween-20。

2. 酶切反應(yīng), 25 °C過夜酶切。

3. (可選)重組腸激酶的去除,后續(xù)如需去除重組腸激酶,可用陰離子交換樹脂(eg.DEAE-FF)對其進(jìn)行洗脫。推薦洗脫條件如下:

平衡緩沖液:25mM Tris-HCl pH8.0

洗脫緩沖液:25mM Tris-HCl pH8.0,含100mM NaCl

注:① 如果使用純化柱,注意流速不要太快。確保樣品與膠的接觸時間不少于10min。也可以直接將膠加入到酶切緩沖液中直接動態(tài)吸附30min。② 如酶切緩沖液中含有其他成分,如NaCl,甘油等,會影響吸附效果。

注意事項(xiàng)

1.如果樣品溶液中含如下成分的一種或多種,且含量大于所列數(shù)值,為獲得理想的酶切結(jié)果,請先將樣品透析到1×反應(yīng)緩沖液中,然后再進(jìn)行酶切實(shí)驗(yàn)。

>2M Urea,>250mM NaCl,>20mM β-ME,>0.1% SDS,>50mM imidazole。

2)磷酸鹽對Enterokinase有很強(qiáng)的抑制作用,痕量的磷酸鹽都會嚴(yán)重影響Enterokinase的活性,因此在酶切體系內(nèi)不能存在磷酸鹽。

 

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